１．目的
ＴＬＣは他のクロマトグラフィーに比べて、簡単な道具で分離でき、安価で手軽に利用できる。実験を通して、クロマトグラフィーの概念を理解する。実験結果を踏まえ置換基の種類による吸着力の強さを理解し、分子の形が電荷の偏り(分子内極性)にどのように影響を与えるかを考え理解する。
２．実験器具と試薬
今回の実験で使用した実験器具と試薬を下記の表に示す。
表１ 実験器具
|
器具名 |
規格 |
数量 |
備考 |
|
ＴＬＣケース |
小 |
1 |
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大 |
1 |
シリカゲル入り |
|
はさみ |
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1 |
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白手袋(布) |
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1 |
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ゴム手袋 |
|
各自一対 |
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定規 |
1mm刻み |
1 |
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ピンセット |
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1 |
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キャピラリー |
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6 |
標準試料5 未知試料1 |
|
キャピラリー台 |
|
1 |
|
|
ＵＶランプ |
long short |
1 |
long wave=366nm |
|
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|
|
short wave=254nm |
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試料ビン |
|
6 |
標準試料5，ヨウ素1 |
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展開槽 |
|
6 |
純溶媒2，混合溶媒4 |
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混合溶液調製ビン |
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4 |
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駒込ピペット |
2ml |
2 |
ヘキサン、ジクロロメタン用 |
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駒込ピペット台 |
|
1 |
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メスシリンダー |
10ml |
2 |
混合溶液調製用 |
|
廃液ビン |
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2 |
ハロゲン、非ハロゲン各１ |
表２ 試薬
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試料 |
規格 |
数量 |
|
|
|
ＴＬＣ（SiO2，蛍光剤含） |
200mm×50mm |
2 |
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アントラセン |
標準溶液 |
1 |
|
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p-ニトロ安息香酸メチル |
標準溶液 |
1 |
|
|
ジフェニルアミン |
標準溶液 |
1 |
|
|
2-メチルナフタレン |
標準溶液 |
1 |
|
|
パルミチン酸メチル |
標準溶液 |
1 |
|
|
未知試料 |
４種から１つ |
1 |
|
|
n-ヘキサン |
試薬ビンから |
1 |
|
|
ジクロロメタン |
試薬ビンから |
1 |
３．試薬の性質
○各試薬の英語名と性質を示す。
アントラセン(anthlacene)：青色の蛍光色を発する無色の板状晶。溶液に日光を当てるとジアントラセンができる
p-ニトロ安息香酸メチル(methyl p-nitrobenzonoate)：皮膚や目を犯す。
ジフェニルアミン(diphenyl amine)：無色で芳香をもつ針状晶。吸引・口径で中毒になる。
2-メチルナフトール(2-methyl naphthalene)：吸引すると有毒である。
パルミチン酸メチル(methyl palmtate)：皮膚や目を犯す。
ヘキサン(hexane)：高可燃性の気体で有毒である。
ジクロロメタン(dichloromethane=methylene chlorate)：有毒性はほとんどなく、皮膚や粘膜に刺激を与える。肝臓・腎臓障害。
○各試薬の物性と構造を以下に示す。
４．実験操作
(１)定性分析
標準試料の５つの化合物を、ヘキサンとジクロロメタンの２種類の溶媒を移動相として用い展開し、それらの性質を調べた。さらに、標準試料の任意の２種が混合された未知試料の同定を行った。
(i)TLCを適切な大きさにハサミで切った。また、ＴＬＣの上端と下端から５mmの所に鉛筆で線を引いた。切るときは手袋をはめて行い、キャピラリーは菅の径が小さく先が平らなものを選んだ。ＴＬＣに軽くキャピラリーを接触させ、直径が１～２mmのスポットが出来るように心がけた。キャピラリーは１つの標準試料について１つのキャピラリーを用い、併用は行わなかった。
(ii)展開槽内が展開溶媒蒸気で満たされるように展開槽を振り拡散を促した。スポットが完全に乾いた後、ＴＬＣを展開槽に入れた。展開溶媒の量は、下の図１に示すようにスポットの点より低くなるように調節した。展開溶媒が上端から５mmの線まできたら、すばやく取り出した。
|
図１ 展開槽内のＴＬＣ |
|
図２ ｍとlの長さ |
(iii)ＴＬＣの展開溶媒を蒸発させた後、ＵＶランプを照射してスポットの検出を行った。検出されたスポットの中央に鉛筆で印をつけた。さらに、Ｉ２でのスポットの検出を行った。ＵＶで検出されかった試料について鉛筆で印をつけた。鉛筆で印をつけた点から原点までの距離ｍと、原点から展開溶媒の先端まで間での距離ｌを測定した。図３のフローチャート用いて各標準試料についてＲｆの算出を行なった。
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|
ＴＬＣの開封 |
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試料の塗りつけ |
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未使用分 |
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ケース内で保存 |
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展開 |
|
|
|
|
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展開槽 |
|
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|
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|
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溶媒を気化させる |
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|
ドラフト内で |
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検出 |
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UVとI2よる検出 |
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Ｒｆ値の算出 |
|
|
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|
|
図３ 実験操作のフローチャート
(iv)適当な展開溶媒を用いて未知試料ついて展開をしてＲｆを算出した。標準試料のＲｆと比較して、未知試料中の２成分がどれであるか推測した。
(v)未知試料に含まれていると推定した２成分と未知試料を１枚のＴＬＣに並べて、スポットし展開を行った。
(２)分離条件の検討
パルミチン酸メチルとp-ニトロ安息香酸メチルの標準試料が展開溶媒(ヘキサン，ジクロロメタン)の混合比を変化させ時のＲｆ値の変化を調べ、２成分のＲｆ値の差⊿Ｒｆを算出した。
(i) ヘキサンとジクロロメタンの混合比が、１：４，２：３，３：２，４：１の混合溶液を班の代表者が調製した。
(ii) パルミチン酸メチルとp-ニトロ安息香酸メチルの標準試料を１枚のＴＬＣに並べてスポットし、まずヘキサンとジクロロメタンで展開させた。ＵＶとＩ２でスポットの位置を検出し、Ｒｆ値を算出した。
(iii) (ii)と同様に、パルミチン酸メチルとp-ニトロ安息香酸メチルの標準試料を１枚のＴＬＣに並べてスポットし、各混合比の混合溶媒で展開させた。ＵＶとＩ２でスポットの位置を検出し、Ｒｆ値を算出した。
５．結果
(１)定性分析
(i)標準試料のＲｆ値
表３ １回目
|
|
ヘキサン |
ジクロロメタン |
ＵＶ |
Ｉ２ |
|||||
|
|
ｌ [mm] |
m [mm] |
Rf [-] |
ｌ [mm] |
m [mm] |
Rf [-] |
long |
short |
|
|
2-メチルナフタレン |
40.0 |
23.2 |
0.580 |
41.0 |
31.8 |
0.776 |
|
紫 |
|
|
アントラセン |
40.0 |
28.2 |
0.705 |
40.1 |
32.6 |
0.813 |
薄紫 |
紫 |
黄 |
|
パルミチン酸メチル |
40.0 |
4.5 |
0.11 |
40.0 |
31.6 |
0.790 |
|
淡黄 |
|
|
p-ニトロ安息香酸メチル |
40.0 |
2.0 |
0.050 |
40.0 |
32.7 |
0.818 |
|
薄紫 |
褐色 |
|
ジフェニルアミン |
40.0 |
6.8 |
0.17 |
41.5 |
28.0 |
0.675 |
|
薄紫 |
緑褐色 |
Ｒｆの値がおかしいものについてＴＡの指示により測定し直した。
表４ ２回目
|
|
ヘキサン |
ジクロロメタン |
ＵＶ |
Ｉ２ |
|||||
|
|
ｌ [mm] |
m [mm] |
Rf [-] |
ｌ [mm] |
m [mm] |
Rf [-] |
long |
short |
|
|
2-メチルナフタレン |
39.5 |
15.7 |
0.397 |
40.0 |
31.0 |
0.775 |
|
紫 |
褐色 |
|
アントラセン |
39.5 |
12.0 |
0.304 |
39.7 |
32.0 |
0.806 |
紫 |
紫 |
褐色 |
|
パルミチン酸メチル |
|
|
|
39.7 |
25.1 |
0.632 |
|
淡黄緑 |
薄褐色 |
|
p-ニトロ安息香酸メチル |
|
|
|
39.7 |
26.5 |
0.668 |
|
薄赤紫 |
薄褐色 |
|
ジフェニルアミン |
|
|
|
40.0 |
27.8 |
0.695 |
|
薄紫 |
|
上記２つの表をまとめると以下のようになる。
表５ Ｒｆ値のまとめ
|
|
ヘキサン |
ジクロロメタン |
||||
|
|
ｌ [mm] |
m [mm] |
Rf [-] |
ｌ [mm] |
m [mm] |
Rf [-] |
|
2-メチルナフタレン |
39.5 |
15.7 |
0.397 |
40.0 |
31.0 |
0.775 |
|
アントラセン |
39.5 |
12.0 |
0.304 |
39.7 |
32.0 |
0.806 |
|
パルミチン酸メチル |
40.0 |
4.5 |
0.113 |
39.7 |
25.1 |
0.632 |
|
p-ニトロ安息香酸メチル |
40.0 |
2.0 |
0.050 |
39.7 |
26.5 |
0.668 |
|
ジフェニルアミン |
40.0 |
6.8 |
0.170 |
40.0 |
27.8 |
0.695 |
(２)未知試料の同定
まず、未知試料Ｃをジクロロメタンで展開をした。その結果を表にした。
表５ 未知試料Ｃ
|
未知試料Ｃ |
ジクロロメタン |
ＵＶ |
|||
|
l [mm] |
m [mm] |
Rf [-] |
long |
short |
|
|
high |
40.0 |
32.2 |
0.805 |
青紫 |
紫 |
|
low |
40.0 |
26.0 |
0.650 |
|
赤紫 |
未知成分に含まれているとＲｆ値だけで予測したものは、アントラセンとp-ニトロ安息香酸メチル、パルミチン酸メチルである。さらに未知試料に含まれていたと考えられる成分を２種に絞る。ＵＶランプのlong waveを当てたとき発色する化合物がアントラセンしかなかったため、１つの成分をアントラセンと推測した。また、未知試料のＲｆ値(high)が定性分析でのアントラセンのＲｆ値ともとても近かったのもアントラセンを選択した理由でもあった。もう１つの成分は、未知試料のＲｆ値(low)が定性分析でのＲｆ値により近く、ＵＶランプのshort waveを当てたとき発色の色が近いp-ニトロ安息香酸メチルを選んだ。実際にジクロロメタンで展開して、ＵＶランプのshort waveを当てるとスポットがちょうど同じ高さに上がっていた。さらに、同じ高にあったスポットの色が一致していた。各高さのスポットの色が、標準試薬のアントラセンとp-ニトロ安息香酸メチルを展開したときの色と同じであった。
この結果により、未知試料Ｃにアントラセンとp-ニトロ安息香酸メチルが含まれていると予測した。
(３)分離条件の検討
ヘキサンとジクロロメタンの混合比を変えて調整した展開溶媒で、標準試料のパルミチン酸メチルとp-ニトロ安息香酸メチルをした結果を示した。その結果を表にした。さらに、その結果をグラフにした。グラフは最後のページに付けた。
表６ 分離条件
|
混合比 |
ヘキサン－ジクロロメタン混合展開液 |
|||||
|
00:100 |
20:80 |
40:60 |
60:40 |
80:20 |
100:00 |
|
|
l [mm] |
39.7 |
39.4 |
39.4 |
39.7 |
39.8 |
39.8 |
|
パルミチン酸メチル m[mm] |
29.8 |
28.1 |
22.6 |
17.9 |
9.0 |
2.2 |
|
p-ニトロ安息香酸メチル m'[mm] |
26.0 |
22.3 |
15.2 |
12.2 |
4.0 |
1.0 |
|
Ｒｆ （パラミチン産メチル） |
0.751 |
0.713 |
0.574 |
0.451 |
0.226 |
0.0553 |
|
Ｒｆ (p-ニトロ安息香酸メチル) |
0.655 |
0.566 |
0.386 |
0.307 |
0.101 |
0.0251 |
|
⊿Ｒｆ（＝|(m-m')／ｌ|） |
0.0957 |
0.147 |
0.188 |
0.144 |
0.126 |
0.0302 |
上記の結果からわかることを述べる。
①極性の少ないヘキサンの比が増すと、Ｒｆ値が小さくなる傾向があるようだった。展開溶媒の極性が少ないと、展開溶媒と試料の結合力が弱い。吸着剤のシリカゲルの末端(ーＯＨ)との静電気引力による結合の方が、展開溶媒が試料を引っ張っていく力より大きいためＲｆ値が伸びなかったのではないだろうか。極性が大きいジクロロメタンではヘキサンと異なり試料との静電気的結合が強いため、ジクロロメタンの比が大きくなるとＲｆ値が大きくなったのではないかと思った。
②分離条件が最も良い状態とは、パルミチン酸メチルとp-ニトロ安息香酸メチルのスポット位置が遠いということである。すなわち、⊿Ｒｆの値が大きい事である。よって、表６もしくはグラフ１を見てもわかるように、⊿Ｒｆが最大値のヘキサンとジクロロメタン混合比が40:60の時が最もパルミチン酸メチルとp-ニトロ安息香酸メチルの分離に適していると考えられる。
６．考察
(１)化合物の構造とＲｆ値の関係
ＴＬＣのような吸着クロマトグラフィーでは、一般的に親水基と言われる極性が高い官能基を持つ化合物は吸着剤への吸着力が強くなりＲｆ値が小さくなる。また、不飽和結があると電荷の偏りが分子内で生じ極性が出来るので、飽和結合の化合物よりもＲｆ値は小さくなる。官能基別の吸着力を示す。
－Cl＜－H＜－OCH3＜ーNO2＜ーN(CH3)＜ーCOOCH3＜ーOCOCH3＜ーC=O＜ーNH2＜ーNHCOCH3＜ーOH＜ーCONH＜ーCOOH
しかし、試料中に存在する官能基の立体配置と分子の大きさによって試料の吸着力が決まるので、一概に官能基とＲｆ値の関係を言うことは出来ない。
(２)標準試料のＲｆ値
ヘキサンはほぼ無極性の化合物なので、展開溶媒がヘキサンの時は官能基と吸着力の関係が直接現れると考えられる。
よって展開溶媒にヘキサンを使ったとき、Ｒｆ値が大きいと化合物に極性が少ないと言える。標準試料でＲｆ値が最も大きいかった２－メチルナフタレンと次に大きかったアントラセンは、Ｒｆ値に大きな差がないのに対して、他の化合物よりも大きな値を取っていた。これは、この２つの化合物がほぼ無極化合物であることを示している。
また、p-ニトロ安息香酸メチルは極性の強いエステル結合とニトロ基の２つの官能基を持っているため、Ｒｆ値が最も小さくなったのだろう。ジフェニルアミンとパルミチン酸メチルでは、アミン基より極性の強いエステル結合を持っているためにパルミチン酸メチルのＲｆ値の方が小さくなったのだろう。
(３)グラフ１、グラフ２
グラフ１では、一見プロットを見ると直線関係に見えるが曲線にした。その理由は、ヘキサンの混合比が少ないときのＲｆ値の変化が比較的少ないのに対して、ヘキサンの混合比が少ないときは、Ｒｆ値の変化が比較的大きかったためである。そのため、展開溶媒の混合比とＲｆ値の関係には比例関係がないと考えたためである。
グラフ２ではプロットした点を見ると、放物線になっていることが明らかである。グラフ１を曲線で引いたことにより、各混合比の時のＲｆ値の差は曲がり方が異なる曲線間の差なので、緩やかな曲線になるはぜであるためである。
７．課題
通常、ＴＬＣプレートに発色剤が塗られているため、その上にＵＶを吸収する試料が載るとＵＶ照射によるＴＬＣプレートの発色が起きなくなり、スポット部分を検出できる。
またＵＶを照射すると、ＵＶの高エネルギーを吸収して化合物中の電子が励起して発色することもある。しかし、二重結合の結合か、芳香環を持っている化合物にしか適用できない。それは、単結合では電子の束縛が大きいσ結合しかなためである。また、３重結合では原子間距離が短いため原子の束縛力が大きいためである。
ヨウ素での検出は、π結合を有する化合物に適用できる。この発色は、ヨウ素が化合物と電荷移動錯体を形成するために起こる。さらには、不飽和化合物やエステルでは付加や置換が起こることもある。
よって、鎖状アルカンのｎ－ヘキサデカンは飽和結合しかないので、ＵＶでは検出できない。また、ヨウ素での検出も単結合しかないので、検出できないと思われる。
ｎーヘキサデカンは直鎖の飽和炭化水素なので極性はほとんどなく、ヘキサンで展開した場合は、ヘキサンに性質がほとんど似ているためＲｆ値が１近くになると思われる。ジクロロメタンで展開すると、ヘキサデカンより極性のあるヘキサデカン酸メチル(パルミチン酸メチル)Ｒｆ値が小さくなると考えられる。
８．参考文献
Gritterら著：入門クロマトグラフィー 第２版，東京化学同人，1988
原昭二ら著：グロマトグラフィー分離システム 考え方，選び方 ，丸善株式会社，1981
玉虫文一ら編集：理化学事典 第３版増補版，岩波書店，1986
http://themerckindex.cambridgesoft.com/ マルク インデックス ウェブ編
http://www.chemexper.com/ ＣＨＥＭＥＸＰＥＲ